Dataset

Sin transformar

Salida Array Quality Metrics sin transformar

• En el gráfico A podemos observar un resumen de todas las muestras y el resultado obtenido del control de outliers. Vemos que según el algoritmo las muestras 1 y 17 podrían presentar algún problema por ello las tendremos en especial consideración cuando observemos los gráficos. En este caso no disponemos de la posibilidad de hacerlo, pero podríamos comprobar las imágenes de los microarrays para ver si ha ocurrido alǵun problema durante su procesado.

• En el gráfico B observamos una agrupación por distancias de los microarrays, vemos que hay una separación clara según el sexo de la muestra, a excepción de las muestras 1 y 17 que muestran una distancia un poco atípica se encuentran más distantes del resto de muestras de machos.

• En el gráfico C observamos los boxplots de las intensidades de cada uno de los arrays. También aparece marcado el array 17 quizá más disperso que el resto, también aparece marcado el 10, sin embargo no parece que sean muestras particularmente aberrantes.

• En el gráfico D podemos observar un análisis por componentes principales, veremos debajo uno como el que se ha realizado durante las prácticas de la asignatura, en este caso vemos una separación clara entre los grupos macho y hembra de las muestras lo cual es esperable y deseable.

• En el gráfico E, vemos que las muestra siguen un mismo patrón, aunque la escala hace un poco complicada esta observación, probaremos luego con una función de affysimple.

• En el gráfico F, el valor esperable es que la mediana sea constante, sin embargo aparece una pequeña joroba en el lado derecho, pero seguramente esté relacionado con una saturación de la intensidades como indica el propio paquete.

• En el gráfico G, podemos observar la comparación de cada uno de los arrays respecto a un pseudo-array que tiene el valor mediano a través del resto de arrays. En este caso lo esperable es que los valores se concentren a lo largo del eje M=0. Sin embargo al no estar transformados los valores aparece agrupados en el margen izquierdo haciendo difícil la visualización.

Vamos ahora a ver un PCA más completo

Vemos una agrupación clara por la condición sexo, no tanto por las condiciones experimentales.

Log-Transform

Array Quality Metrics Output

Al estar transformados con el logaritmo la forma de las gráficas cambia ya que hemos estirado la distribución. El significado de los gráficos es el mismo que en el apartado anterior.

El array 17 sigue apareciendo como un outlier, sin embargo en ninguno de los plots aparece particularmente dramático por tanto lo conservaremos.

affyPLM

Vamos ahora a utilizar la librería affyPLM vamos a ajustar un modelo a nivel de sonda y vamos a comprobar las gráficas RLE y NUSE.

En el caso del RLE vamos a encontrar una medida estandarizada de la expresión, que ha de ser similar a través de arrays, y en el caso de NUSE observaremos los residuos normalizados del modelo cuya distribución ha de ser similar a través de arrays.

No parece que ninguno de los arrays se desvíe particularmente en ninguna de las dos gráficas (quizá la c_1_m_1), si que vemos que hay una diferencia clara entre sexos. Podríamos preguntarnos en este caso si se ha cometido algún error y los machos perteneces a un batch y las hembras a otros, es decir hemos generado algún tipo de confound.

Conclusiones de calidad

• Conservamos todos los arrays
• Podría ser útil revisar el 17
• Podría ser útil consultar si ha habido alguna diferencia sistemática entre los arrays de machos y hembras, batch, fecha, operario,…

Array quality metrics output después de la normalización

Array Quality Metrics Output

Los gráficos son los mismos que en apartados anteriores, ahora vemos una separación mucho más clara en el array de distancias. El array número 17 ahora es más similar al resto.

Solo existen dos detalles destacables, uno es la diferencia entre patrones de intensidad en la figura E entre las muestras machos y hembras, y la joroba que aparece en la figura F, cuando la mediana debería de ser plana, quizá sea debida a la diferencia entre sexos.

Conclusiones

Los datos parecen correctos, por tanto no es necesaria ninguna acción.

Genes diferencialmente expresados entre condiciones

Las tablas permiten ordenar y filtrar los genes en función de diversos parámetros. Solamente se incluyen los 1000 genes más significativos por cada comparación.

Se incluyen los p-valores ajustados usando false discovery rate.

Volcano plot

Aquí presentamos un volcano plot con algunos extras sobre el original, con los p-valores ajustados y sin ajustar. Además se incluye una tabla con el porcentaje de genes diferencialmente expresados en cada uno de los contrastes. Se incluye el corte en p<.05 para valores ajustados y sin ajustar.

Volcano plot modificado. Las líneas horizontales indican p-valor=.05. Las líneas verticales indican el un fold-change de 2.

Diagrama de Venn

Los resultados que aparecen aquí están corregidos al p<.05, con el p-valor corregido a través de múltiples comparaciones con FDR (Bejamini Hochberg) y se han considerado los contrastes de manera separada para esta correción.

Diagrama de Venn que muestra el número de contrastes significativos encada uno de los contrastes y sus intersecciones.

Tabla de anotaciones

Se ha generado (aunque no sea accesible desde el documento, si que está en el repositorio de git) con todos los genes anotados que han resultado signficativos en cada uno de los contrastes.

Archivo: ‘annotations.html’

## Warning in result_fetch(res@ptr, n = n): SQL statements must be issued with
## dbExecute() or dbSendStatement() instead of dbGetQuery() or dbSendQuery().

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## dbExecute() or dbSendStatement() instead of dbGetQuery() or dbSendQuery().

Interpretación de los resultados

Para los resultados de cada uno de estos análisis presentamos el mismo conjunto de tablas y resultados. Una tabla que muestra los resultados obtenidos, con información relevante sobre cada uno de ellos y un enlace a cada uno de los elementos de la GO o KEGG encontrados. Los tipos de gráficos varían según el tipo de análisis.

En el caso de KEGG cuando una ruta resulta significativa, el diagrama de la ruta se descarga y se colorea dependiendo de la expresión de los genes incluidos en la ruta para el análisis.

Gene Ontology

Over-representation analysis

Macho vs. Hembra

En este caso aparecen muchos genes relacionados con los diferentes términos de GO y la visualización se hace un poco complicada. Un upsetplot hubiese sido más útil, pero en este caso el paquete daba un error de compatibilidad que no he sido capaz de solucionar.

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Resistente vs. Sensible

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Resultados de sobrerrepresentación para GO

Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)

Gene Set enrichment analysis

Macho vs. Hembra

Resultados de GSE para GO

Resultados de GSE para GO

Resistente vs. Sensible

Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)

KEGG

Over-representation analysis

Contrast	Rutas sobrerrepresentadas
Macho vs. Hembra	2
Resistente vs. Sensible	0
Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)	4

Macho vs. Hembra

Resultados de sobrerrepresetanción para KEGG

Resultados de sobrerrepresetanción para KEGG

Resistente vs. Sensible

Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)

Resultados de sobrerrepresetanción para KEGG

Resultados de sobrerrepresetanción para KEGG

Gene Set enrichment analysis

Contrast	Rutas sobrerrepresentadas
Macho vs. Hembra	0
Resistente vs. Sensible	2
Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)	0

Macho vs. Hembra

Resistente vs. Sensible

Resultados de GSE para KEGG

Resultados de GSE para KEGG

Interacción Sexo y (Resistente vs. Sensible)